Evidencia de infección por retrovirus y paramixovirus de múltiples especies de murciélagos en China https://t.me/QAnons_Espana

Junio 2014

Lihong Yuan , Min Li , Linmiao Li , Corina Monagin , Aleksei A. Chmura , Bradley S. Schneider , Jonathan H. Epstein , Xiaolin Mei , Zhengli Shi , Peter Daszak y Jinping Chen

Resumen: Los murciélagos son reservorios reconocidos de muchos virus zoonóticos emergentes de importancia para la salud pública. Identificar y catalogar los virus de los murciélagos es un enfoque lógico para evaluar la gama de zoonosis potenciales de origen murciélago. https://t.me/QAnons_Espana

Caracterizamos el microbioma del patógeno fecal de murciélagos insectívoros y frugívoros, incorporando 281 murciélagos individuales que comprenden 20 especies comunes, que se muestrearon en tres lugares de la provincia de Yunnan, mediante la combinación de ensayos de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) y secuenciación de próxima generación.

Siete murciélagos individuales dieron positivo para paramixovirus por RT-PCR utilizando cebadores degenerados, y estos paramixovirus se clasificaron principalmente en tres géneros (Rubulavirus, Henipavirus y Jeilongvirus). Se detectaron varios patógenos novedosos adicionales en los murciélagos positivos para paramixovirus utilizando la secuenciación Illumina. Se construyeron un total de 7066 contigs ensamblados (≥200 pb), y 105 contigs correspondían a virus eucariotas (de ellos, 103 pertenecen a 2 familias de virus de vertebrados, 1 virus de insectos y 1 micovirus), 17 eran parásitos y 4913 eran homólogos a procariotas. microorganismos.

Entre los 103 contigs virales de vertebrados, 79 mostraron una identidad baja (<70 %) con virus conocidos, incluidos virus humanos, a nivel de aminoácidos, lo que sugiere que pertenecen a virus nuevos y genéticamente divergentes. En general, los virus identificados con mayor frecuencia, particularmente en murciélagos de la familia Hipposideridae, fueron los retrovirus.

El presente estudio amplía nuestra comprensión del viroma de murciélago en especies que se encuentran comúnmente en Yunnan, China, y proporciona información sobre la diversidad general de virus que pueden ser capaces de cruzar directa o indirectamente a los humanos.
Palabras clave: murciélago; metagenómica; hipposideridae; patógenos; emergencia viral; viroma; zoonosis. https://t.me/QAnons_Espana

1. Introducción
   Los murciélagos (orden Chiroptera) comprenden el segundo grupo de mamíferos más grande del mundo y están ampliamente distribuidos en seis continentes [1]. Numerosas especies de murciélagos han sido implicadas como reservorios naturales de importantes virus zoonóticos, incluidos los virus Ébola y Marburg; virus Nipah y Hendra; coronavirus del SRAS; y más recientemente [2–5]. Colectivamente, los murciélagos albergan una amplia diversidad de virus, y se ha propuesto que familias y géneros virales completos, como pararmixovirus, hepacivirus y pegivirus, pueden haberse originado en murciélagos [6,7]. Se han detectado más de 170 virus en murciélagos, y muchos de estos virus son altamente patógenos para los humanos [8], incluidos los virus Nipah y Hendra [9], el virus de la rabia [10], el Lyssavirus del murciélago australiano [11] y el virus Marburg [ 12], y el coronavirus similar al SARS [13]. En particular, el brote de coronavirus del SARS en 2002, que se originó en murciélagos de herradura en China e infectó a más de 8000 personas en todo el mundo, ha estimulado mayores esfuerzos de la comunidad internacional de investigación para caracterizar la diversidad y distribución de virus de murciélagos en todo el mundo [4,14 ].
   Se han identificado más de 120 especies de murciélagos en China, y muchas están ampliamente distribuidas en las provincias sureñas de Yunnan, Guangdong, Guangxi y Fujian [15]. Estas especies de murciélagos más ubicuas, que pertenecen a los géneros Rousettus, Myotis, Miniopterus e Hipposideros, residen naturalmente en las proximidades de los humanos, lo que aumenta el potencial de transmisión de patógenos zoonóticos a los humanos. Se han identificado paramixovirus altamente patógenos en una variedad de vertebrados, incluidos los humanos, y la reconstrucción filogenética de las asociaciones de huéspedes sugiere un predominio de cambios de huésped de murciélagos a otros mamíferos y aves [6], y a menudo causa brotes graves de enfermedades [16,17] . Por lo tanto, la evaluación de la variedad de paramixovirus que circulan en murciélagos en China podría brindar una guía importante para el control y la prevención de futuras epidemias. https://t.me/QAnons_Espana
   Recientemente, la secuenciación de alto rendimiento (p. ej., Illumina, Solexa, etc.), una técnica rápida y eficiente que utiliza la amplificación de ácidos nucleicos independiente de la secuencia seguida de la secuenciación rápida, se ha empleado con gran éxito para descubrir una enorme diversidad de virus en un rango de muestras, incluyendo agua marina y dulce [18,19], tejidos animales [20,21], heces humanas y muestras de heces, orina y orales de murciélagos [22–29]. En este estudio, utilizamos la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) para estudiar la prevalencia de paramixovirus en murciélagos de Yunnan, China, y luego realizamos la secuenciación Illumina para caracterizar los paramixovirus de muestras de murciélagos. Hasta la fecha, este es el primer análisis metagenómico informado en muestras fecales de murciélagos insectívoros y frugívoros en China. https://t.me/QAnons_Espana

2. Experimental
   2.1. Declaración de Ética
   Este estudio fue aprobado por el Panel Administrativo del Instituto Entomológico de Guangdong sobre Cuidado de Animales de Laboratorio (Guangzhou, China). Todos los murciélagos fueron liberados ilesos inmediatamente después del muestreo.
   2.2. Recolección de muestras y preparación de ácidos nucleicos virales. https://t.me/QAnons_Espana
   Entre noviembre de 2011 y marzo de 2012, se recolectaron un total de 562 muestras de hisopos orales y rectales de 281 murciélagos individuales de 20 especies en múltiples sitios en la provincia china de Yunnan. De las muestras recolectadas, 252 muestras (44,84%) fueron de 126 murciélagos insectívoros y 310 muestras (55,16%) de 155 murciélagos frugívoros. Los lugares de muestreo incluyen el agujero Yuanjiang Gulong (N23°35.180′, E101°57.540′; H: 405 m), el Jardín Botánico Xishuangbanna (N: 21°55.368′, E: 101°15.235′, H: 535 m), y el Arco Natural (N: 21°59.235′, E: 101°21.418′, H: 919 m). Las muestras se suspendieron en una solución tampón de fosfato (PBS) con antibióticos y se almacenaron a -80 °C hasta la extracción del ácido nucleico. Para conocer los detalles del muestreo, como números, ubicaciones y especies específicas de murciélagos, consulte la Tabla S1.
   https://t.me/QAnons_Espana Para extraer el ácido nucleico viral, las suspensiones de hisopos se centrifugaron a 5000 × g durante 10 min. Luego, el sobrenadante se transfirió a tubos nuevos y se centrifugó a 12 000 x g durante 20 min. El ADN y el ARN virales se extrajeron simultáneamente de una muestra de 140 μL con el kit QIAamp Viral RNA Mini (QIAgen, Düsseldorf, Alemania) según el protocolo del fabricante y se eluyeron en 60 μL de tampón AVE.
   2.3. Detección de paramixovirus y análisis filogenético. https://t.me/QAnons_Espana
   Se realizaron ensayos de RT-PCR sensibles y ampliamente reactivos en el Instituto de Virología de Wuhan, Academia de Ciencias de China. En este estudio, los cebadores, que se diseñaron de acuerdo con los motivos conservados de la secuencia codificante de la ARN polimerasa (L), fueron de la referencia Tong et al. [30], y podría utilizarse para la identificación de nuevos paramixovirus. Se amplificaron los fragmentos de 560 pb de la secuencia codificante de la ARN polimerasa (L) conservada en la subfamilia Paramyxovirinae, según la referencia de Tong et al. [30] sin modificaciones. Las producciones de PCR se secuenciaron utilizando kits Big Dye Terminator (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) en un secuenciador automático ABI 3730 con cebador PAR-R. https://t.me/QAnons_Espana
   Para evaluar la relación filogenética de los paramixovirus identificados en este estudio, se descargaron 79 secuencias parciales y completas de nucleótidos del gen L del NCBI con los números de acceso de GenBank enumerados en la Tabla S2. Las secuencias de nucleótidos se alinearon y tradujeron utilizando ClustalX 1.83 [31]. El modelo de mejor ajuste (GTR + I + G) de la relación filogenética fue determinado por Modeltest 3.7 [32] y los árboles filogenéticos del gen L fueron construidos por MrBayes 3.1.1 [33], con las secuencias de la subfamilia Pneumovirinae como un grupo externo.2.4. Secuenciación de alto rendimiento y análisis de patógeno.Para caracterizar aún más los virus coinfectados en muestras positivas para paramixovirus de murciélago, se llevó a cabo la secuenciación de alto rendimiento de Illumina. Los ácidos nucleicos totales se extrajeron como se describe anteriormente. A continuación, se agruparon las muestras de ácido nucleico viral y se usó una muestra agrupada de 3 µg para la preparación de la biblioteca de secuenciación. La síntesis de ADNc de primera y segunda cadena a partir del ARN viral se realizó utilizando oligonucleótidos aleatorios/SuperScript II y ADN polimerasa I/RNasa H, respectivamente. Después de la adenilación del extremo 3′, los fragmentos de ADN se ligaron con adaptadores Illumina PE en ambos lados para purificar y enriquecer selectivamente los fragmentos de 200 pb utilizando el sistema AMPure XP (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE. UU.) e Illumina PCR Primer Cocktail en un Reacción de PCR de 10 ciclos. Finalmente, se generó una biblioteca de secuenciación con el kit de preparación de muestras de ARN Illumina TruSeqTM (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.) siguiendo las recomendaciones del fabricante y se agregaron cuatro códigos de índice a las secuencias de atributos. El agrupamiento de las muestras codificadas por índice se realizó en un sistema de generación de clústeres de cBot con el kit de clústeres TruSeq PE v3-cBot-HS (Illumina, Inc.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la generación de grupos, las preparaciones de la biblioteca se secuenciaron en una plataforma Illumina Hiseq 2000 y se generaron lecturas de extremos emparejados de 100 pb. Las lecturas contaminadas con el adaptador o de baja calidad, así como las lecturas poli-N, se eliminaron de los datos sin procesar y se obtuvieron lecturas limpias. https://t.me/QAnons_Espana
3. 2.5. Identificación de secuencias homólogas virales
4. Las lecturas limpias de Illumina se compilaron con ensamblaje de novo, utilizando algoritmos de ensamblaje de gráficos de Bruijn [34], y los contigs <200 pb de longitud no se analizaron más. Las secuencias restantes se sometieron a una búsqueda secuencial BLASTx en la base de datos GenBank para eliminar los contigs de bacterias y eucariotas e identificar secuencias virales sospechosas, que tenían más de 200 pb, y se consultó la clasificación taxonómica desde el servicio web de taxonomía NCBI. Se recuperó la secuencia de referencia del organismo fuente con la mejor alineación contig (es decir, la alineación con el valor e más bajo ≤ 0,0001). Se eliminaron los cóntigos de bacterias y eucariotas. Si la taxonomía de la secuencia de referencia era viral y se alineaba con el contig con un valor e de ≤0,0001, la secuencia se marcaba como sospechosa de ser viral y se conservaba para un análisis posterior.
5. 2.6. Análisis filogenético de secuencias virales. https://t.me/QAnons_Espana
6. Se excluyeron las secuencias virales sospechosas relacionadas con familias de virus de invertebrados. Las secuencias de referencia se descargaron de NCBI. Las alineaciones globales con contigs se generaron utilizando ClustalX 1.83 [31], se tradujeron en MEGA 5 [35] y se editaron con BIOEDIT v7.0 [36]. A continuación, MrBayes 3.1.1 [33] utilizó alineaciones desprovistas de huecos para construir los árboles filogenéticos.
7. 2.7. Números de acceso de secuencia de nucleótidos
8. Los datos de la secuencia de Illumina obtenidos en este estudio se han depositado en la base de datos Sequence Read Archive (SRA) (número de acceso SRX368740). Los cóntigos virales de vertebrados recortados y agrupados (≥200 pb) utilizados para el análisis filogenético en este estudio se depositaron en GenBank (número de acceso KF547868-KF547871).

3. Resultados
   3.1. Detección de Paramixovirus
   Entre las muestras, siete muestras fecales de siete murciélagos individuales fueron identificadas como positivas para paramixovirus, y en estos murciélagos, dos individuos pertenecen a Hipposideros cineraceus (muestreados en el agujero de Yuanjiang Gulong), uno de Rousettus leschenaultii, uno de Eonycteris spelaea, uno de Hipposideros armiger (muestreados del Jardín Botánico Xishuangbanna, Mengla, China) y tres Taphozous melanopogon (muestreados en Natural Arch, Mengla, China) (Tabla S1). Las secuencias del gen L de ~560 pb se enviaron a GenBank (número de acceso KC599255, KC599257-KC599261, KC599263). https://t.me/QAnons_Espana
   El árbol filogenético del gen L, basado en una alineación de 529 pb, se muestra en la Figura 1. El análisis filogenético indica que las secuencias de paramixovirus identificadas en este estudio están separadas en tres géneros distintos. De ellos, KC599259 identificado en R. leschenaultii estaba agrupado con Rubulavirus. KC599257 detectado en E. spelaea mostró una estrecha relación con los paramixovirus de Eidolon helvum en África urbana, que formaron un clado hermano no clasificado del género Henipavirus. El tercer grupo es el de cinco nuevos paramixovirus que comparten un ancestro común y forman un subgrupo filogenéticamente diverso, estrechamente relacionado con el género Jeilongvirus, que comprende el Jeilongvirus (J-virus) y el virus Beilong [37]. Además, este grupo se puede dividir en dos clados, KC599255 y KC599258 de Hipposideridae; y KC599260, KC599261 y KC599263 de T. melanopogon (familia Emballonuridae). El análisis de identidad de aminoácidos deducido apoyó la relación filogenética observada usando las secuencias de nucleótidos (Tabla S3). KC599259 tenía la homología más baja (37,58 %–40,61 %) con otras secuencias de paramixovirus identificadas en este estudio y tenía una mayor identidad (61,49 %–78,74 %) con el Rubulavirus conocido y el virus relacionado con el Rubulavirus. Los nuevos paramixovirus (KC599255, KC599258, KC599260, KC599261 y KC599263) de murciélagos insectívoros compartían las identidades de aminoácidos más altas (74,55 %–100 %) y tenían una homología relativamente alta con Jeilongvirus (74,25 %–78,44 %) y KC599257 (59,39 %). %–64,85%). Por otro lado, KC599257 estaba más estrechamente relacionado con los henipavirus (92,94 %).
   3.2. Análisis en profundidad de patógenos mediante la secuenciación de alto rendimiento de Illumina
   Illumina produjo lecturas de secuencias individuales con puntuaciones de calidad base. Después de eliminar las lecturas contaminantes (0,01 % de las lecturas del adaptador, 2,43 % de lecturas de baja calidad y 0,38 % de lecturas que contienen N), se obtuvieron un total de 7 963 701 lecturas limpias (97,15 %) en este estudio (Figura 2A). https://t.me/QAnons_Espana
   3.2.1. Contigs ensamblados y análisis BLASTx
   Se construyeron un total de 7066 contigs ensamblados (≥200 pb) y se obtuvieron 6880 contigs con valor e ≤ 0,0001. Los datos mostraron que el contig más largo fue de 6481 pb y 310 contigs tenían más de 1000 pb. Un total de 73,1% (5029/6880) de contigs asociados a microorganismos. 118 cóntigos que eran homólogos a virus eucariotas y fagos. Además, encontramos 17 contigs que eran homólogos de parásitos.

FUENTE 👉 http://www.ecohealthalliance.org/wp-content/uploads/2016/11/Yuan-et-al_virus-bats_viruses-2014.pdf